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编者按

 肾近端小管(PTs)是肾单位的一个高度特化的部分，执行肾脏的大部分重吸收和分泌功能。它们的独特作用和高代谢活性使PTs极易受到毒素和代谢应激的影响。因此，含有高成熟度PT细胞的类器官将成为药物开发、毒理学研究和PT功能障碍研究的重要工具。

近年来，通过干细胞体外培养产生的具有三维结构的微型肾脏模型为肾脏发育、肾脏疾病致病机理研究以及肾脏再生提供了强大的工具，其中由多功能干细胞诱导成肾类器官的技术愈发成熟，并且这些类器官显示出与发育中的人类肾脏显著的转录相似性，但目前诱导的类器官中肾单元模式和功能分割仍然不成熟，其中PT的成熟和功能分割尤其不发达。

2022年10月8日 ，墨尔本默多克儿童研究所的Vanslambrouck Jessica M研究团队在Nature Communications（IF=16.6）上发表了最新研究成果，该研究开发了一种后肾小管分化技术，用于在肾脏类器官中模拟功能性近曲小管，从而实现对毒性筛选和传染病建模的应用。PT增强的类器官为研究人类近曲小管成熟、遗传性和获得性近曲小管疾病及药物和病毒反应提供了一个精确的模型。

文章题目

Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids

杂志：Nature Communications（IF=16.6）

发表时间：2022.10.8

作者：Vanslambrouck Jessica M,Wilson Sean B,Tan Ker Sin et al.

单位：墨尔本默多克儿童研究所、澳大利亚墨尔本大学等

01、研究结果

1. 延迟肾单元诱导可以产生肾单元祖细胞

鉴于初始分化条件和时间对肾单元祖细胞存活和后续肾单元形态的明显影响，研究人员在扩增培养肾单元祖细胞群体的同时推迟对肾单元的诱导。

结果证明，延迟诱导会产生更多的肾单元群体，并且在化学成分确定的CDBLY2介质参与下，所培养的肾单元祖细胞的分化程度和均一性更强，且PCR验证其诱导分化后的细胞的肾相关表达基因更显著，从而产生具有更好形态和 PT 增强的类器官。

图1

2. 延长培养时间可诱导Six2+肾单元祖细胞衍生成为近端肾单元

先前有报道表明，体内肾单元完全来自于SIX2+肾单元祖细胞分化而来，但在类器官中肾单元含有来自 SIX2+的细胞，但也有来自SIX2-的细胞相互嵌合组成。

为了证实并比较肾单元祖细胞富集单层分化对肾单元形成的贡献能力，研究者们使用SIX2Cre/Cre:GAPDHdual谱系追踪线，采用标准方案和PT增强方案去诱导类器官。使用足细胞、近端和远端小管的一系列标记物检测出类器官中显示出明显的近端远端分割。

与标准方案产生的类器官具有分支GATA3 +上皮相比，扩展方案衍生的类器官具有表达输尿管上皮标记物GATA3的少数结构。延长的培养方案产生的类器官具有肾单元的中心环和向外辐射的细长PTs，这与标准类器官中这些结构更均匀的分布截然相反，且PT增强方案诱导的类器官中SIX2+ 细胞对近端肾小管的形成贡献更大。

图2

3. PT增强类器官显示近端小管成熟度有所提高

为了确定PT增强类器官中近端小管的成熟程度，研究者们通过免疫荧光评估了成熟 PT 所特有具有重要功能的刷状缘膜蛋白和标记物的表达及细胞定位情况。

结果表明与正常类器官相比，PT增强类器官中蛋白转运复合体CUBILIN-MEGALIN (CUBN-MEG) 和中性氨基酸转运体 SLC6A19高表达，且近端小管表型更成熟，刷状边界膜发育更理想，并且通过全转录组比较发现，PT增强类器官中近端小管细胞的所占比例更高，与人体肾脏内基因的表达有更高的一致性。

图3 

4. 局部WNT拮抗驱动肾元细胞的径向排列

所有 PT 增强的类器官中都观察到了特征性的径向图案，其中肾小管与其肾小球朝类器官中心排列，围绕着中心核心区域，而远端 SLC12A1 + 区段则朝类器官外围排列。先前的研究不仅表明间质/基质群在肾单元分化中的作用，而且还表明近端-远端模式化是由沿肾单元轴的 Wnt/β-catenin 信号控制的。

较低的WNT信号可促进近端肾元的形成和成熟，因此PT增强类器官的中心核心可能拥有影响肾元模式的基质群体或表达局部WNT拮抗剂，从而导致定向信号提示，同时检测皮层基质、软骨前和髓质间质等标志物的表达差异，表明中央核心区域可能控制WNT通路介导的肾元模式，进而驱动所观察到的径向排列，后续通过比对验证，发现PT增强类器官中WNT 拮抗剂 SFRP2 和前软骨标志物的表达明显更高。

图4 

5. 功能增强的肾元类器官使药物筛选成为可能

为了验证在PT增强的类器官中，转运蛋白的高表达和顶端细胞定位可以表明构建的类器官具有了肾元的部分功能，研究者们通过培养基中添加荧光标记物，结果表明PT增强的类器官中物质运输的功能远强于普通类器官，且这种行为是可以在药物的作用下进行调控，具有转运活性的特异性，相比之下，标准类器官未显示标记物的摄取，表明其转运体功能不成熟。

在建立的 PT 增强类器官中验证了其具有白蛋白和有机阳离子转运能力之后，进而评估了它们对肾毒性损伤的反应。通过顺铂诱导PT增强类器官和标准类器官后获取二者的 scRNAseq数据集，对比发现与标准类器官相比，PT增强型类器官中大多数顺铂流入和流出转运体的表达量更高，具有更高的顺铂转运能力，且PT增强类器官中肾损伤基因的表达上均高于标准类器官，表明PT增强类器官可以作为顺铂诱导肾毒性的有利模型。

图5 

6. 改进的PTs类器官提高了SARS-CoV-2研究的适用性

在疾病模型中，为了研究肾脏损害是由直接的病毒感染还是炎症反应和药物肾毒性联合引起的，研究者们利用改进的PTs类器官，研究了它们作为SARS-CoV-2感染和发病机制模型的适用性。

对多个来源的类器官细胞scRNAseq数据进行综合分析，结果显示与现有的标准类器官数据集相比，近端和远端管段的SARS-CoV-2进入因子在PT增强类器官中的表达水平和丰度都显著表达，病毒的感染性方面PT增强类器官检测到感染性病毒的时间更早且病毒表达丰度更高，并且感染后类器官的扩增性较现有的类器官来说有很大提高。

图6 

02、编者点评

综上，本研究开发了一种后肾小管分化技术，用于在肾脏类器官中模拟功能性近曲小管，从而实现对毒性筛选和传染病建模的应用。

研究中通过改进多能干细胞衍生的肾脏类器官的分化条件，成功诱导形成了具有延长和对齐的近曲小管段以及SLC12A1阳性的肾单位。这种经过PT增强的器官组织具有更好的白蛋白和有机阳离子吸收能力，对顺铂有毒性反应，SARS-CoV-2 进入因子的表达得到改善，从而增加了病毒复制。肾单元的显著近轴定向来自于源自类器官基质核心的局部 WNT 拮抗作用，因此，PT增强型类器官是研究遗传性和获得性近端肾小管疾病以及药物和病毒反应的改良模型。

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